隨著(zhù)國內生物制藥行業(yè)的迅速發(fā)展，細胞灌注培養越來(lái)越受到人們關(guān)注，因為其可以在較小體積的生物反應器中獲得高的細胞密度，其中細胞截留裝置是灌流培養工藝開(kāi)發(fā)非常關(guān)鍵的一項，邁博瑞基于常年在過(guò)濾、分離及純化行業(yè)的積累，提出了利用深層過(guò)濾機制來(lái)應對灌流生物反應袋過(guò)濾部件提出的挑戰，并成功開(kāi)發(fā)出Cellgard細胞截留板。

 

目錄

1.一次性生物反應袋發(fā)展進(jìn)程 一次性生物反應袋 帶過(guò)濾器的一次性生物反應袋 一次性灌流生物反應袋 2.一次性灌流生物反應袋的基本要求 3.一次性灌流生物反應袋應用及挑戰 一次性灌流生物反應袋主要應用 一次性灌流生物反應袋在高細胞密度中面臨的挑戰 4.邁博瑞Cellgard細胞截留板 5.Cellgard細胞截留板性能實(shí)驗分析 實(shí)驗一：2L細胞培養 實(shí)驗二：50L細胞培養 6.邁博瑞Cellgard細胞截留板的優(yōu)勢

 

一、一次性生物反應袋發(fā)展進(jìn)程

1、一次性生物反應袋

1998年，Wave Biotech公司推出了Wave Bioreactor®搖擺式生物反應器系統，該系統采用一次性生物反應袋Cellbag®作為細胞及微生物培養容器。經(jīng)過(guò)市場(chǎng)多年的使用驗證，一次性搖擺式生物反應器系統及其所配套的耗材，已經(jīng)在全球范圍內得到廣泛的接受與認可。隨著(zhù)生命科學(xué)及生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展，行業(yè)主體對細胞培養的要求越來(lái)越高，更高的細胞培養密度、更短的培養周期、更低的培養成本、更高的培養成功率等。因此，一次性生物反應器耗材制備技術(shù)、生物培養工藝等學(xué)科也在不斷發(fā)展，更新迭代。

圖1：®示意圖（圖片來(lái)自GE）

 

2、帶過(guò)濾器的一次性生物反應袋

2001年，Dr. Vijay Singh發(fā)明了帶過(guò)濾器的一次性生物反應袋產(chǎn)品，見(jiàn)圖2（專(zhuān)利號US6544788），該產(chǎn)品能夠將目標物質(zhì)，如細胞、微生物等，通過(guò)所述的“過(guò)濾器”截留在反應袋內部，同時(shí)將廢培養基液體通過(guò)“過(guò)濾器”排出反應器外，并且實(shí)現新鮮培養基加入，從而實(shí)現了在Wave Bioreactor®及一次性反應袋產(chǎn)品中連續化灌注培養細胞及微生物，為微生物培養工藝、生物制藥上游細胞擴增工藝提供了有力的工具。

圖2：帶過(guò)濾器的一次性生物反應袋示意圖（圖片來(lái)源：US6544788）

 

3、一次性灌流生物反應袋

該技術(shù)發(fā)展到今天，最為行業(yè)所熟知的產(chǎn)品，即為Cytiva公司在售的XuriTM系列一次性灌流生物反應袋產(chǎn)品，見(jiàn)圖3。隨著(zhù)專(zhuān)利US6544788的到期，全球一次性耗材生產(chǎn)商也陸陸續續開(kāi)始了一次性灌流生物反應袋產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化工作。

圖3：XuriTM系列一次性灌流生物反應袋產(chǎn)品（圖片來(lái)自Cytiva）

 

二、一次性灌流生物反應袋的基本要求

一次性灌流生物反應袋的基本要求，是在產(chǎn)品使用者的生物培養工藝條件下，保證所培養的微生物或細胞，達到預期的增殖密度，且在該過(guò)程中，起到截留作用的“過(guò)濾器”不堵塞，即液體能夠在較低的壓力下通過(guò)所述過(guò)濾裝置，同時(shí)，“過(guò)濾器”能夠有效截留被培養物質(zhì)，即過(guò)濾裝置下游幾乎無(wú)微生物或細胞穿透。因此，由上述可見(jiàn)，“過(guò)濾器”的截留性能是決定一次性灌流生物反應袋能否滿(mǎn)足使用要求的關(guān)鍵核心部件。

 

三、一次性灌流生物反應袋應用及挑戰

1、一次性灌流生物反應袋主要應用

1. 一次性灌流生物反應袋的一個(gè)重要應用點(diǎn)，位于生物制藥工藝環(huán)節中的細胞擴增工藝段。
2. 在細胞擴增階段，使用者期望能夠通過(guò)灌流培養的工藝，實(shí)現對于CHO等工程細胞的高密度細胞培養。

高密度CHO細胞灌流培養的益處為：

• 一方面，可以提高細胞擴增效率，甚至有可能減少1-2個(gè)細胞擴增工藝步驟，節省時(shí)間、原材料、金錢(qián)、人力成本，減少染菌風(fēng)險，提高成功率
• 另一方面，在一些利用工程細胞表達目標蛋白、收獲病毒載體、獲得mRNA疫苗的小規模研產(chǎn)活動(dòng)中，高細胞培養密度能夠帶來(lái)更高的目標物滴度，并提高效率

 

下圖4比較了一個(gè)用常規方法將細胞擴大到500L生產(chǎn)用生物反應器（n）中的例子，使用高密度細胞庫方法減少了中間兩個(gè)轉瓶培養的步驟，可以直接接種到2L的波浪生物反應器中。使用波浪生物反應器（2L和20L）代替轉瓶（125ml到10L）大大減少了需要在超凈臺中操作的次數。這種替換使整個(gè)過(guò)程在一個(gè)封閉系統中進(jìn)行，提高了操作成功率。

圖4：常規與改進(jìn)的細胞培養工藝過(guò)程比較（圖片來(lái)源：Bioprocess Int）

 

2、一次性灌流生物反應袋在高細胞密度中面臨的挑戰

高細胞密度對于灌流生物反應袋的挑戰是巨大的，尤其當細胞密度上升后，對于過(guò)濾部件的壓力尤為明顯。

• 高細胞濃度時(shí)，過(guò)濾部件需要能夠維持灌流工藝的進(jìn)行，此即要求過(guò)濾部件面對高濃度料液挑戰時(shí)不被堵塞；
• 再者，被培養物，如細胞、微生物等由于本身結構柔軟，在較低壓力驅動(dòng)下極容易穿透過(guò)濾介質(zhì)。
• 另外一個(gè)容易被忽視的地方，在于灌流生物反應袋中的過(guò)濾部件在整個(gè)培養過(guò)程中是隨著(zhù)Wave Bioreactor®不斷“隨波逐流”的，長(cháng)時(shí)間的培養需求對過(guò)濾部件的機械可靠性能提出了更高的要求。

綜上，一款合格的適用于Wave Bioreactor®的截留過(guò)濾部件需要滿(mǎn)足高載量、長(cháng)壽命、高截留效率、高機械可靠性等要求。邁博瑞基于常年在過(guò)濾、分離及純化行業(yè)的積累，提出了利用深層過(guò)濾機制來(lái)應對灌流生物反應袋過(guò)濾部件提出的挑戰，并成功開(kāi)發(fā)出Cellgard細胞截留板。

 

三、邁博瑞Cellgard細胞截留板

邁博瑞開(kāi)發(fā)的Cellgard細胞截留板是利用超高分子量聚乙烯粉末燒結工藝制成的一種深層過(guò)濾介質(zhì)，見(jiàn)圖5，有17×17cm和50×30cm兩種尺寸，厚度為3mm，見(jiàn)圖6。針對生物制藥行業(yè)對于工程細胞（如CHO DG44細胞，CHO K1細胞，HEK 293細胞等）擴增培養的具體需求，Cellgard板材的孔徑被設計為7μm，同時(shí)，Cellgard高達300N/mm的穿刺強度，大大提高了截留部件的機械可靠性。這樣的設計，能夠良好的滿(mǎn)足灌流生物反應袋對截留過(guò)濾部件提出的挑戰。在MS與客戶(hù)的灌流細胞培養評測實(shí)驗中，Cellgard細胞截留板均完美的實(shí)現了不同條件下的細胞培養并達到測試預期。

圖5：MS Cellgard細胞截留板

圖6：MS Cellgard細胞截留板尺寸示意圖

 

四、Cellgard細胞截留板性能實(shí)驗分析

實(shí)驗一：2L細胞培養

圖7：灌流式生物反應袋結構示意圖

 

在第一組測試中，尺寸為17×17cm2的Cellgard細胞截留板被制作成2L灌流式生物反應袋（見(jiàn)上示意圖7）。該測試主要考察樣品灌流袋在未有蛋白表達情況下的細胞擴增情況，所用細胞株為CHO K1。在設置的另外兩組平行實(shí)驗中，同樣規格大小的兩個(gè)2L灌流反應袋分別裝載標稱(chēng)孔徑1微米的微濾膜及競品細胞截留板作為灌流過(guò)濾部件。該測試約定，當出現細胞泄露、截留板堵塞、細胞活率下降至90%以下等情況時(shí)，停止實(shí)驗。

在為期8天的培養過(guò)程中，裝配有Cellgard細胞截留板的反應袋中的細胞濃度順利增殖到近120 M/ml的濃度，Day 7-8的培養中，跨膜壓差略微上升，細胞活率略下降，但是膜后收獲液未見(jiàn)細胞泄露，與平行對照組相比，同期細胞活率未見(jiàn)明顯區別，	裝載微濾膜的反應袋Day 5出現嚴重的堵塞現象且下游伴隨約30%的細胞泄露，細胞活率較好，	裝載有競品截留板的反應袋Day 3出現細胞泄露，至Day 5時(shí)，泄露率達30%以上，細胞活率維持較好，
圖8：Cellgard 2L WAVE 培養天數與細胞密度、細胞活率、跨膜壓差、細胞泄露趨勢圖	圖9：微濾膜 2L WAVE 培養天數與細胞密度、細胞活率、跨膜壓差、細胞泄露趨勢圖	圖10：競品截留板 2L WAVE 培養天數與細胞密度、細胞活率、跨膜壓差、細胞泄露趨勢圖

 

實(shí)驗二：50L細胞培養

第二組測試主要考察被培養的細胞在表達蛋白的情況下，Cellgard截留板作為過(guò)濾部件的表現。所用Cellgard截留板尺寸為30×50cm2，反應袋體積為50L。該培養實(shí)驗的預設目標，是利用灌流式生物反應袋將CHO細胞培養至70 M/ml的細胞濃度，并至少維持5天以上，同時(shí)觀(guān)察蛋白表達及收獲液中的蛋白收率情況

本次培養起始階段細胞接種密度為0.3 M/ml，3天后細胞順利進(jìn)入對數生長(cháng)期，到Day 10時(shí)達到最高細胞密度84.7 M/ml。經(jīng)灌流速率、供養等參數調控后，培養密度順利維持在70 M/ml以上并保持較高的細胞活率，	同時(shí)，細胞蛋白表達亦進(jìn)入對應的高峰期。經(jīng)測量反應袋內及截留板下游蛋白濃度，可得收獲端蛋白收獲率。Cellgard細胞截留板上下游幾乎無(wú)法測出蛋白濃度差，蛋白收獲率近100%，見(jiàn)圖12。該特性相較利用微濾膜、超濾膜技術(shù)實(shí)現灌流功能的器件相比，具有獨特的優(yōu)勢。	灌流培養進(jìn)行至Day 18時(shí)，Cellgard細胞截留板下游開(kāi)始探測到有活細胞穿透，此時(shí)對應的跨膜壓差增長(cháng)到50mbar。隨著(zhù)灌流培養繼續進(jìn)行，跨膜壓差繼續增長(cháng)，細胞穿透更加明顯，而細胞蛋白表達及下游收獲率幾乎不受影響，見(jiàn)圖13。細胞穿透的原因一般是由于跨膜壓差的驅動(dòng)使得細胞發(fā)生了形變而穿越了截留板的微孔結構。我們建議用戶(hù)在實(shí)際培養過(guò)程中監控跨膜壓差，并根據實(shí)際培養情況調整培養工藝。
圖11：50L灌流袋細胞培養天數與細胞密度、細胞活率趨勢圖	圖12：50L灌流袋細胞培養天數與mAB濃度、mAB收獲率趨勢圖	圖13：50L灌流袋細胞培養天數與跨膜壓力、收獲液細胞密度趨勢圖

 

至此，在兩種不同培養工藝條件下，Cellgard截留板均實(shí)現了高細胞培養密度、高截留率、長(cháng)使用壽命的目標，培養情況均符合實(shí)驗預期。Cellgard產(chǎn)品能夠為一次性灌流式生物反應器的高密度細胞培養提供有力支撐。應當注意的是，由于用戶(hù)不同的培養工藝可能導致不同的培養結果，以上兩組實(shí)驗數據僅供參考，不可視為標準結果。 

 

五、邁博瑞Cellgard細胞截留板的優(yōu)勢

• 利用深層過(guò)濾機制，可實(shí)現更高密度的細胞培養，且抗堵塞能力強；
• 更高的機械強度，避免使用過(guò)程中出現因機械損傷導致的泄露；
• 特殊的孔徑設計，避免細胞泄露前提條件下，對蛋白等目標產(chǎn)物幾乎無(wú)截留。

 

Cellgard細胞截留板產(chǎn)品現已開(kāi)放試用，歡迎新老客戶(hù)咨詢(xún)，產(chǎn)品尺寸可根據用戶(hù)需求進(jìn)行訂制，詳情請咨詢(xún)您身邊的MS銷(xiāo)售工程師。

 

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